IPTG (איזאָפּראָפּיל-β-D-טהיאָגאַלאַקטאָסיד) איז אַן אַנאַלאָג פון β-גאַלאַקטאָסידאַז סאַבסטראַט, וואָס איז העכסט אינדוצירבאר. אונטער דער אינדוקציע פון IPTG, קען דער אינדוצירער פֿאָרמען אַ קאָמפּלעקס מיטן רעפּרעסאָר פּראָטעין, אַזוי אַז די קאָנפֿאָרמאַציע פֿון רעפּרעסאָר פּראָטעין ווערט געביטן, אַזוי אַז עס קען נישט קאָמבינירט ווערן מיטן ציל גען, און דער ציל גען ווערט אויסגעדריקט עפֿעקטיוו. אַזוי ווי זאָל מען באַשטימען די קאָנצענטראַציע פֿון IPTG בעת דעם עקספּערימענט? איז וואָס גרעסער אַלץ בעסער?
ערשטנס, לאָמיר פֿאַרשטיין דעם פּרינציפּ פֿון IPTG אינדוקציע: E. coli'ס לאַקטאָזע אָפּעראָן (עלעמענט) כּולל דריי סטרוקטורעלע גענעס, Z, Y, און A, וואָס קאָדירן β-גאַלאַקטאָסידאַז, פּערמעאַז, און אַסעטילטראַנספֿעראַזע, בהתאמה. lacZ הידראָליזירט לאַקטאָזע אין גלוקאָזע און גאַלאַקטאָז, אָדער אין אַלאָ-לאַקטאָזע; lacY דערלויבט לאַקטאָזע אין דער סביבה צו דורכגיין די צעל מעמבראַנע און אַרייַן די צעל; lacA טראַנספֿערירט די אַסעטיל גרופּע פֿון אַסעטיל-CoA צו β-גאַלאַקטאָסיד, וואָס באַטרעפֿט אַוועקנעמען דעם טאָקסישן עפֿעקט. אין דערצו, איז דאָ אַן אָפּערירנדיק סיקוואַנס O, אַן אָנהייב סיקוואַנס P און אַ רעגולאַטאָריש גענע I. דער I גענע קאָד איז אַ רעפּרעסאָר פּראָטעין וואָס קען בינדן צו דער פּאָזיציע O פֿון דער אָפּעראַטאָר סיקוואַנס, אַזוי אַז דער אָפּעראָן (מעטאַ) ווערט רעפּרעסירט און אויסגעלאָשן. עס איז אויך דאָ אַ בינדונג אָרט פֿאַר קאַטאַבאַליש גענע אַקטיוואַטאָר פּראָטעין-CAP בינדונג אָרט אַפּסטרים פֿון דער איניציאַטיוו סיקוואַנס P. די P סיקוואַנס, O סיקוואַנס און CAP בינדונג אָרט צוזאַמען קאָנסטיטוטירן די רעגולאַטאָרישע געגנט פֿון דעם lac אָפּעראָן. די קאָדירנדיקע גענעס פון די דריי ענזימען ווערן רעגולירט דורך דער זעלבער רעגולאַטאָרישער געגנט צו דערגרייכן די קאָאָרדינירטע אויסדרוק פון גען פּראָדוקטן.
אין דער אָפּוועזנהייט פון לאַקטאָז, איז דער לאַק אָפּעראָן (מעטאַ) אין אַ צושטאַנד פון רעפּרעסיע. אין דעם מאָמענט, בינדט זיך דער לאַק רעפּרעסאָר, אויסגעדריקט דורך דער I סיקוואַנס אונטער דער קאָנטראָל פון דער PI פּראָמאָטער סיקוואַנס, צו דער O סיקוואַנס, וואָס פאַרהיט RNA פּאָלימעראַזע פון בינדן זיך צו דער P סיקוואַנס און אינהיביטירט טראַנסקריפּציע איניציאַציע; ווען לאַקטאָז איז פאָרשטעלן, קען דער לאַק אָפּעראָן (מעטאַ) ווערן אינדוצירט. אין דעם אָפּעראָן (מעטאַ) סיסטעם, איז דער עכטער אינדוצירער נישט לאַקטאָז אַליין. לאַקטאָז גייט אַרײַן אין דער צעל און ווערט קאַטאַליזירט דורך β-גאַלאַקטאָסידאַזע צו ווערן קאָנווערטירט צו אַלאָלאַקטאָז. די לעצטע, ווי אַן אינדוצירער מאָלעקול, בינדט זיך צו דעם רעפּרעסער פּראָטעין און ענדערט די פּראָטעין קאָנפאָרמאַציע, וואָס פירט צו דער דיסאָסיאַציע פון דעם רעפּרעסער פּראָטעין פון דער O סיקוואַנס און טראַנסקריפּציע. איזאָפּראָפּילטהיאָגאַלאַקטאָסידע (IPTG) האט די זעלבע ווירקונג ווי אַלאָלאַקטאָז. עס איז אַ זייער שטאַרקער אינדוצירער, וואָס ווערט נישט מעטאַבאָליזירט דורך באַקטעריע און איז זייער סטאַביל, אַזוי עס ווערט וויידלי געניצט אין לאַבאָראַטאָריעס.
ווי אזוי צו באַשטימען די אָפּטימאַלע קאָנצענטראַציע פון IPTG? נעמט E. coli ווי אַ בייַשפּיל.
דער E. coli BL21 גענעטיש אינזשענירטער שטאַם וואָס ענטהאַלט דעם פּאָזיטיוון רעקאָמבינאַנטן pGEX (CGRP/msCT) איז געוואָרן אינאקולירט אין LB פליסיקן מעדיום וואָס ענטהאַלט 50μg·mL-1 Amp, און קאָלטיווירט איבער נאַכט ביי 37°C. די אויבנדערמאָנטע קולטור איז געוואָרן אינאקולירט אין 10 פלעשער פון 50mL פרישן LB פליסיקן מעדיום וואָס ענטהאַלט 50μg·mL-1 Amp אין אַ פּראָפּאָרציע פון 1:100 פֿאַר עקספּאַנסיע קולטור, און ווען דער OD600 ווערט איז געווען 0.6~0.8, איז IPTG צוגעגעבן געוואָרן צו דער לעצטער קאָנצענטראַציע. עס איז 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. נאך אינדוקציע ביי דער זעלבער טעמפעראטור און דער זעלבער צייט, איז 1 מל פון דער באַקטיריעלער לייזונג גענומען געווארן דערפון, און די באַקטיריעלע צעלן זענען געזאמלט געווארן דורך צענטריפוגאציע און אונטערגעווארפן צו SDS-PAGE צו אנאליזירן דעם איינפלוס פון פארשידענע IPTG קאנצענטראציעס אויף פּראָטעין אויסדרוק, און דערנאך אויסקלויבן די IPTG קאנצענטראציע מיט דער גרעסטער פּראָטעין אויסדרוק.
נאך עקספערימענטן, וועט מען געפינען אז די קאנצענטראציע פון IPTG איז נישט אזוי גרויס ווי מעגליך. דאס איז ווייל IPTG האט א געוויסע טאקסיקיטעט פאר באקטעריע. איבערשטייגן די קאנצענטראציע וועט אויך הרגענען די צעל; און בכלל גערעדט, האפן מיר אז ווי מער אויפלעזלעך פראטעין אויסגעדריקט אין דער צעל, אלץ בעסער, אבער אין פילע פעלער ווען די קאנצענטראציע פון IPTG איז צו הויך, וועט א גרויסע מאס איינשליסונג געשאפן ווערן. קערפער, אבער די מאס אויפלעזלעך פראטעין ווערט פארקלענערט. דעריבער, די מערסט פאסיגע IPTG קאנצענטראציע איז אפט נישט ווי גרעסער אלץ בעסער, נאר ווי נידעריגער די קאנצענטראציע.
דער ציל פון אינדוקציע און קולטיוואציע פון גענעטיש אינזשענירטע שטאמען איז צו פארגרעסערן די פּראָדוקציע פון דעם ציל פּראָטעין און רעדוצירן קאָסטן. די אויסדרוק פון דעם ציל גען ווערט נישט נאָר באַאיינפלוסט דורך די אייגענע פאַקטאָרן פון דעם שטאַם און דעם אויסדרוק פּלאַזמיד, נאָר אויך דורך אַנדערע עקסטערנע באַדינגונגען, ווי די קאָנצענטראַציע פון דעם אינדוצירער, די אינדוקציע טעמפּעראַטור און די אינדוקציע צייט. דעריבער, בכלל, איידער אַן אומבאַקאַנט פּראָטעין ווערט אויסגעדריקט און פּיוראַפייד, איז עס בעסטער צו שטודירן די אינדוקציע צייט, טעמפּעראַטור און IPTG קאָנצענטראַציע כּדי צו אויסקלייבן די פּאַסיקע באַדינגונגען און באַקומען די בעסטע עקספּערימענטאַלע רעזולטאַטן.
פּאָסט צייט: 31 דעצעמבער 2021